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Biologie Heute entdecken Schulbuch SII 2004, ISBN 3-507-10560-8

Seite 459

Methoden des Gentransfers

Transgene Lebewesen entstehen durch das gezielte Einschleusen von Fremd-Genen. Für den erfolgreichen Gentransfer müssen je nach Zielzelle verschiedene Transfermethoden eingesetzt werden: biologische Systeme, die DNA oder RNA selbst aktiv übertragen können (Agrobacterium, Viren) oder physikalische Methoden zur Übertragung unverpackter, nackter DNA (Elekroporation, Partikelpistole, Liposomen, Mikroinjektion). Der Gentransfer mit Agrobacterium funktioniert recht gut bei zweikeimblättrigen Pflanzen, einkeimblättrige Pflanzen infiziert Agrobacterium normalerweise nicht. Ziel aller Methoden ist es, die in Frage kommenden Gene in das gewünschte Genom stabil einzubauen und ihre Expression zu erreichen. Insgesamt spricht man von einem Gentransfer, wenn die neuen Gene auch an die Nachkommen vererbt werden.

Astra/Johnson - Adenovirus

Viren

Das Fremdgen wird in ein wirtsspezifisches Virus einebaut. Das Virus infiziert die Zelle und schleust dabei die Fremd-DNA ein. Verwendet man Retroviren, wird das Fremdgen in das Genom der Zelle eingebaut.

Pfizer/Moderna Lipidnanopartikel

Liposomen

Fremd-DNA wird von einer künstlich hergestellten Doppel-Lipidschicht eingeschlossen. Die so entstehenden Vesikel verschmelzen mit der Doppel-Lipidschicht der Zellmembran und entlassen ihre DNA ins Zellinnere.

Die Diskussion über fehlende DNA ist obsolet. Plasmide und sogar manchmal vollständiges Chromosom von E. Coli in allen Proben nachweisbar. Bedingt durch den Herstellungsprozess.

Extra für die Plörre angefertige Änderungen (Plural) des Arzneimittelgesetzes haben es möglich gemacht.

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Biochemie und Molekularbiologie des Menschen,2009, ISBN 978-3-437-43690-1

Seite 462

Kapitel 15.5 Gentherapie

15.5.1 Gentherapeutische Verfahren

Genetische Veränderung in vivo

…

Um DNA in die Zellen im Patienten einzubringen (In-vivo-Gentransfer), benötigt man geeignete Vektoren. Grundsätzlich werden virale und nichtvirale Vektoren unterschieden. Zu den gebräuchlichsten Vektoren gehören Retroviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren sowie Herpesviren. Die Vektor-DNA wurde gentechnologisch verändert, indem ein Teil der Virus-DNA entfernt wurde, um so für die zu transferierende therapeutische DNA Platz zu schaffen. Dabei hat man v.a. die Gene entfernt, die für die Virusvermehrung essenziell sind. Dadurch wird sichergestellt, dass die Viren sich nicht wie bei einer normalen Infektion vermehren können. Weitere Manipulationen des Vektors haben zum Ziel, die Infektiosität zu erhöhen und die Immunogenität zu verringern.

• Retroviren: sie infizieren nur sich teilende Zellen. Danach integrieren sie in das Wirtsgenom. Dadurch wird eine andauernde Expression des Transgens garantiert. Nachteilig ist noch die geringe Effizienz der Infektion. Retrovirale Vektoren führen zu einer irreversiblen genetischen Veränderung der Zellen des Patienten, und sie leiten sich von einer Gruppe von Viren ab, die u.a. Tumoren induzieren können und zu denen auch das AIDS-auslösende HIV gehört.

…

• Adenovirale Vektoren: Ihr Vorteil ist, dass sie auch sich nicht teilende (sog. postmitotische) Zellen infizieren können, z.B. die Zellen des Nervensystems. Nachteilig ist, dass sie nicht in das Genom integrieren. Sie gehen deshalb rasch verloren und ermöglichen damit nur eine "transiente" Expression der Fremd-DNA. Außerdem zeigen sie eine relativ hohe Immunogenität.

• Nichtvirale Vektoren: Hierzu gehören v.a. die Liposomen. Dies sind Partikel mit einer Lipidhülle unterschiedlicher Zusammensetzung. In dieser Hülle, die mit der Zielmembran verschmelzen kann, wird die DNA eingeschlossen. Nach Fusion mit der Zelle gelangt der Inhalt des Liposoms in das Zytoplasma.

Auch die Injektion von reiner DNA kann zur Expression führen. Insbesondere Muskelzellen zeichnen sich durch eine effiziente Expression nach diesen einfachen Transferverfahren aus.

Biochemie und Molekularbiologie des Menschen, ISBN 978-3-437-43690-1

Kapitel 15 Grundlagen der Gentechnik

Seite 440

Merke: Die DNA-Klonierung ist die Vermehrung eines fremden DNA-Moleküls in einem Wirtsorganismus

Vektoren

Um beim Klonierungsprozess die DNA in die Wirtszelle einzuschleusen und dort zu vermehren, benötigt man einen Vektor als Trägermolekül, in das die zu vermehrende DNA eingebaut wird. Der Einbau erfolgt durch Restriktionsverdau und Ligation. Die fremde DNA bezeichnet man als Insert.

Vektoren besizten Eigenschaften, die es erlauben, sie (mitsamt Insert) leicht in die Wirtszelle einzuschleusen. Fremd-DNA, die ohne Vektor in eine Zelle gelangt, wird sehr schnell abgebaut.

Außerdem müssen Vektoren die Signale für eine autonome Replikation enthalten. Meist tragen sie noch Marker- oder Selektionsgene, die es erlauben, den Prozess der DNA-Klonierung zu verfolgen und zu steuern. Alle heute in der Gentechnolgie verwendeten Vektoren leiten sich von Molekülen ab, die dem natürlicherweise vorkomenden Gentransfer zwischen Zellen und Organismen dienen.

Plasmide

Dies sind relativ kleine ringförmige doppelsträngige DNA-Molelüle von mehreren tausend Basenpaaren, die v.a. in Bakterien vorkommen. Sie besizten einen Replikationsursprung, der die Replikation unabhängig vom Bakterienchromosom erlaubt.

Bestimmte Plasmide (sog. High-copy-number-Plasmide) können in bis zu 100 Kopien pro Bakterienzelle vorliegen. In der Regel sind Plasmide für die Bakterien entbehrlich, allerdings können plasmidcodierte Gene, z.B. für eine Antibiotikaresistenz, dem Träger einen Selektionsvorteil verschaffen. Natürlich vorkommende Plasmide können von einer Zelle auf eine andere übertragen werden. Dieser "horizontale" Gentransfer ermöglich eine schnelle Ausbreitung plasmidkodierter Gene in einer Bakterienpopulation. Diese kann so z.B. wesentlich effektiver gegen ein Antibiotikum resistent werden, als wenn das Plasmid nur durch Zellteilung weitergegeben würde.

Plasmide sind damit prädestiniert, DNA von außen in eine Bakterienzelle einzubringen.

Die Gentechnik nutzt Plasmide als sehr effektive Vektoren für kurze DNA-Fragmente (wenige Basenpaare bis ca 10 Kilobasenpaare). Das Einbringen eines Plasmids in eine Bakterienzelle wird als Transformation bezeichnet. Aufgrund ihrer kleinen und kompakten ringförmigen Struktur unterscheiden sich Plasmide in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften von der hochmolekularen, ausgestreckten genomischen DNA des Bakterienchromosoms. So zeigen sie z.B. ein unterschiedliches Sedimentationsverhalten bei der Dichtegradientenzentrifugation oder eine erhöhte Resistenz gegen Denaturierung durch Alkali. Dies ermöglicht die Isolierung und Aufreinigung am Ende des Vermehrungsprozesses.

Zur Vermehrung von Plasmiden wird meist das Darmbakterium Escherichia Coli (E. coli) verwendet, das zum "Arbeitspferd" der Gentechnologie wurde. Alle Laborstämme tragen bestimmte Defektmutationen, die verhindern, dass sie sich außerhalb des Labors vermehren können.

Die Plörre wurde nicht gereinigt. Die Kosten hat man sich einfach gespart. Hat jemand eine Sequenzierung zur Hand, die beweist oder widerlegt, dass auch wirklich der Labor-Stamm verwendet wurde?

Die humanisierten ACE2-Mäuse hat man sich aus Kostengründen ja auch gespart.

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ISBN 978-3-437-43690-1

Kapitel 11 Das genetische Material

Seite 328

Enzyme, die eine RNA-Matrize benutzen, um DNA zu synthetisieren, werden reverse Transkriptasen genannt.

Seite 342

Transposons

Neben den repetitiven Satelliten, die in den Chromosomen in Blöcken vorkommen, enthält das menschliche Genom hochrepetitive DNA, die vereinzelt und nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom verstreut vorkommt. Solche Elemente, die auch als Transposons bezeichnet werden, kommen wahrscheinlich in allen Eukaryonten vor und sind bewegliche Elemente des Genoms. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihren angestammten Ort im Chromosom verlassen können und sich an anderer Stelle wieder in das Genom integrieren. Daher liegen sie überall verstreut im menschlichen Genom.

Einige dieser Elemente, die sog. DNA-Transposons, "springen" als DNA-Moleküle, wobei sie das Enzym für ihre Integration an einem anderen Ort selbst kodieren (Abb. 11.33).

Dieses Enzym trägt den Namen Integrase. Die meisten der mobilen Elemente des Menschen bewegen sich jedoch nicht selbst, sondern "verschicken" RNA-Transkripte, die mithilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) in DNA-Kopien umgeschrieben werden und sich anschließend an einer neuen Stelle in das Genom einnisten. Diese Elemente, die RNA als Intermediate verwenden, nennt man retrotransposable Elemente.

Im Gegensatz zu den DNA-Transposons führt dieser Vorgang zur Vermehrung der Elemente im Genom. Sie werden in 2 Klassen unterteilt:

solche, die an ihren beiden Enden eine lange wiederholte Sequenz (LTR = long terminal repeat) tragen, und solche, denen diese Sequenz fehlen. Zu den LTR-tragenden Elemente zählen neben den Retrotransposons, die außerhalb des Zellkerns nicht existieren können, auch die Retroviren, die die Zelle verlassen und dann andere Zellen und Individuen infizieren können. Die häufigsten LTR-freien Elemente, die sog Retroposons, sind im menschlichen Genom die LINEs (long interspersed elements) und die SINEs (short interspersed, die zusammen ca. 35% des Genoms ausmachen.

Seite 346

DNA-Viren

Viren mit einem doppelsträngigen DNA-Genom

Die doppelsträngige DNA (dsDNA) gelangt in den Zellkern, wo zelluläre Enzyme die DNA transkribieren und die gebildete RNA prozessieren (Abb. 11.35, a). Die mRNA wird im Zytosol der Wirtszelle translatiert. Einige prominente Beispiele dieser Klasse von Viren sind:

• Adenoviren: Sie verursachen bei vielen Tieren und beim Menschen Infektionen des oberen Respirationstrakts sowie des Gastrointestinaltrakts und dienen zur Gentherapie als Vektoren zum Einbringen von Genen in Zellen (Kap. 15.5)

• SV40-Virus (Simian-Virus-40): Dieses Affenvirus wird als Modell für Untersuchungen der DNA-Replikation im Laboratorium häufig verwendet.